La fluorescencia es un efecto físico causado por la emisión de energía luminosa cuando una sustancia es iluminada por luz u otras formas de radiación electromagnética. La microscopía de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza fluorescencia y fosforescencia in situ o en combinación con reflexión y absorción para estudiar las propiedades ópticas de objetos orgánicos e inorgánicos. La microscopía de fluorescencia ayuda a ver con mayor claridad las estructuras subcelulares e internas de los objetos. Fue descubierto a principios del siglo XX por August Köhler, Carl Reichert y Heinrich Lehmann.
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Cómomicroscopio fluorescenteobras
Trabajo de microscopía de fluorescencia.
Componentes del microscopio de fluorescencia
1. fluoróforo
2. fuente de luz
3. Filtro de excitación
4.Espejo dicroico
5. Filtro de descarga
Ventajas de la microscopía de fluorescencia
Desventajas de la microscopía de fluorescencia.
Usos de la microscopía de fluorescencia.
Cómo funciona la microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia suele funcionar tiñendo la composición y estructura de una muestra con tintes. Esto se debe a que la mayoría de los componentes celulares son de naturaleza incolora. Por tanto, no es fácil distinguirlos entre sí. Los fluoróforos o moléculas fluorescentes iluminadas con luz de longitud de onda corta o rayos electromagnéticos tienden a emitir luz. La luz emitida tiene una longitud de onda más larga en comparación con la luz incidente. Normalmente, la duración entre la irradiación y la emisión se mide en nanosegundos y puede ignorarse fácilmente. La luz emitida se separa de la luz incidente, lo que indica la ubicación exacta del fluoróforo. La imagen de la muestra se genera basándose en luz secundaria en lugar de luz incidente primaria.
Trabajo de microscopía de fluorescencia.
La microscopía de fluorescencia funciona de manera similar a la microscopía óptica. Consiste en una fuente de luz potente, un filtro de paso de banda especial y una etiqueta fluorescente de la muestra. La muestra a estudiar se coloca bajo un microscopio. Se ilumina la muestra con luz con una longitud de onda lo suficientemente corta como para excitar el fluoróforo. Con la ayuda de una lente objetiva, esta luz se enfoca sobre la muestra. Los rayos de excitación emitidos por la muestra se enfocan luego en el detector a través de la lente objetivo. La mayor parte de la luz de excitación se transmite a través del objeto de muestra, mientras que una parte se refleja y llega al detector.
Componentes del microscopio de fluorescencia
1. fluoróforo
Un fluoróforo es un compuesto que emite luz cuando se excita mediante ondas electromagnéticas o de luz. También se le llama tinte fluorescente. Los fluoróforos consisten básicamente en una combinación de grupos aromáticos o moléculas planas/cíclicas con varios enlaces π.
2. fuente de luz
La fuente de luz es uno de los componentes más importantes de un microscopio de fluorescencia. En este caso, las fuentes de luz más comunes utilizadas para la excitación incluyen láseres, LED de alta potencia, lámparas de arco de xenón, lámparas de vapor de mercurio, etc.
3. Filtro de excitación
Los filtros de excitación utilizados en microscopía de fluorescencia suelen ser filtros de paso de banda, que permiten señales que caen dentro de un ancho de banda específico y rechazan todas las demás señales. Las longitudes de onda absorbidas por el fluoróforo pasan fácilmente, mientras que la radiación óptica reflejada queda bloqueada.
4.Espejo dicroico
Los espejos dicroicos actúan como filtros de película fina. El objetivo principal de un espejo dicroico es dejar pasar selectivamente la luz de una pequeña gama de colores mientras refleja todos los demás colores. También se le conoce como filtro de color preciso.
5. Filtro de descarga
El filtro de emisión es un filtro de paso de banda. Los filtros de emisión funcionan de manera similar a los filtros de excitación. Irradia luz emitida por el fluoróforo mientras bloquea la luz de excitación.
Ventajas de la microscopía de fluorescencia
1. La sensibilidad de la microscopía de fluorescencia es muy alta, equivalente a aproximadamente 50 moléculas por micrómetro cúbico.
2. Con la microscopía de fluorescencia, se pueden teñir diferentes moléculas de diferentes colores, lo que permite a los usuarios obtener imágenes de múltiples moléculas de una sustancia al mismo tiempo.
3. Los microscopios de fluorescencia son más eficientes que los microscopios ópticos tradicionales.
4. Puede usarse para imágenes in vivo e in vitro.
5. La microscopía de fluorescencia puede separar proteínas individuales con alta precisión.
6. La microscopía de fluorescencia es más adecuada para obtener imágenes y estudiar los comportamientos dinámicos que exhiben las células vivas.
7. La microscopía de fluorescencia es capaz de producir imágenes claras y de alta resolución, lo que mejora la investigación.
8. Combina las propiedades de aumento de la microscopía óptica con la visualización de fluorescencia.
9. La microscopía de fluorescencia se puede utilizar para generar imágenes ampliadas en 3D de la muestra que se está estudiando.
Desventajas de la microscopía de fluorescencia.
1. Los compuestos fluorescentes o fluoróforos presentes en la microscopía de fluorescencia tienden a perder su capacidad de emitir luz con el tiempo cuando se excitan debido a un proceso llamado fotoblanqueo. El fotoblanqueo suele ocurrir cuando una molécula de fluoróforo se daña químicamente debido a la excitación electrónica durante la fluorescencia.
2. Sólo permite la observación y estudio de determinadas estructuras de la muestra que hayan sido resaltadas y etiquetadas como fluorescentes.
3. Cuando los materiales fluorescentes son irradiados con luz, las moléculas fluorescentes a menudo producen sustancias químicas, lo que conduce aún más a la fototoxicidad. Este efecto fototóxico destruye las propiedades originales de la muestra observada. La fototoxicidad de la radiación luminosa de longitud de onda corta es relativamente alta.
4. La microscopía de fluorescencia no puede proporcionar información sobre la bicapa lipídica, especialmente en el caso de los SUV.
5. La microscopía de fluorescencia no puede producir observaciones concluyentes relacionadas con el carácter bicapa o la lamelaridad de las vesículas.
6. La adición de sondas y colorantes a menudo interfiere con las propiedades de las vesículas lipídicas, lo que lleva a una interpretación inexacta de los datos y, por lo tanto, destruye la autenticidad del experimento.
7. La peroxidación lipídica inducida por la luz puede conducir a la formación de dominios.
Usos de la microscopía de fluorescencia.
1. La microscopía de fluorescencia se utiliza ampliamente para estudiar la estructura interna de muestras a nivel microscópico con la más alta calidad.
2. La microscopía de fluorescencia es la más adecuada para estudiar muestras biológicas vivas.
3. Este tipo de microscopio suele ser el preferido para marcar las estructuras más internas de células o microorganismos.
4. Ayuda a medir el estado fisiológico de las células o muestras que se están observando.
